CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合，并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。 与传统ChIP-Seq相比，该技术无需交联与超声打断操作，规避了抗原决定簇遮盖和样本损失问题，提高了信噪比，所需细胞量减少（可低至60个）。与CUT&Run相比，该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列，可直接PCR建库，无需末端抹平和接头连接的操作，省时高效。 CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端，应用于临床和科研的表观遗传学研究。
关于CUT&Tag的文库构建，主要分为以下几步：
1、富集细胞进行裂解，提取纯化细胞核；
2、分别孵育一抗和二抗；
3、pA/G-Tn5酶孵育；
4、激活转座子，进行DNA片段化;
5、纯化片段化后的DNA；
6、扩增纯化产物；
7、分选扩增后的DNA长度，去除非目的片段。
分析流程
1、首先利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；
2、再使用BWA或bowtie软件将原始数据比对到参考基因组；
3、然后用MACS分别对每例样本进行峰挖掘（peak calling),
4、之后对peaks 区域进行基因组位置注释、motif分析，并对靶基因进行GO和KEGG富集分析；
5、若具有多种实验组样本，可挖掘各组样本间具有差异的peaks进行特异性分析等。
CUT&Tag样本送样指南
目录
1. 采集前注意事项
2. 送样要求
3. 样品送样指南
动物组织
植物组织
细胞
4. 样品包装与储存
5. 样品运输
6. 声明
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
1. 采集前注意事项
| 重复性 | 所有类型样本均需≥3个/组 |
| 无污染 | 放置样本的管子需无菌， 并保证样本新鲜 |
| 为实现实测序结果，请保证样本无其他微生物污染（如：支原体，噬菌体） | |
| 样本量 | 样本送量需达到本文档中规定的最低要求 |
2. 送样要求
| 项目类型 | 细胞样本 | 组织样本 | |||||
| 细胞活率 | 细胞核个数 | 要求冻存的细胞个数 | 活细胞个数 | 动物组织 | 植物组织 | ||
| 冻存前 | 复苏后 | ||||||
| CUT&Tag | ≥ 90 % | ≥ 85 % | ≥ 4万 | 12-15万/管 | 10-12万/管 | ≥200 mg 100 mg/样 | ≥2 g 1 g/样 |
注：组织样本包含动植物组织样本
3. 样品送样指南
| 动物组织 | |
新鲜组织 ≥ 100 mg | 活体取样，剔除结缔组织以及其它非研究组织 |
| 用预冷的PBS漂洗（PBS需不含Mg2+和Ca2+ ， 即DPBS） ，去除血液和杂质 | |
| 体积较大的组织需切割成绿豆大的小块 | |
| 将样本装入事先做好标记的组织保存液管中， 立即放在冰上 | |
| 冷冻组织 | 活体取样，剔除结缔组织以及其它非研究组织 |
| 用预冷的PBS漂洗（PBS需不含Mg2+和Ca2+ ， 即DPBS） ，去除血液和杂质 | |
| 将样本装入标记的冻存管中， 立即液氮速冻2 min或- 80 ℃保存。如没有液氮，立即在干冰上放置15min ，-80 ℃保存 | |
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
| 植物组织 | |
| 新鲜组织 | 植物CUT&Tag只接受新鲜样本，待测样本用dd H2O洗去组织表面泥土等杂质，吸干水分 |
要求每个样本准备2份，每份样本的质量≥1 g ，单独分装 | |
| 细胞 | |
| 新鲜细胞 | 仅限武汉地区运输， 细胞个数应达到1-1.2×105个，细胞活率应>90 % |
| 将样本制备成悬浮细胞，贴壁细胞需先消化好 | |
| 细胞用培养基悬浮， 装满离心管， 防止运输过程中晃动， 管盖用封口膜封住，标记好样本信息 | |
| 冷冻细胞 | 贴壁细胞：吸掉培养基，加入适量1×PBS，用不含Mg2+和Ca2+ 的PBS(即DPBS)，洗2次， 洗尽培养基,胰酶消化细胞， 利用完全培养基终止反应， 将贴壁细胞吹下后， 转移至冻存管，细胞悬液在4 °C条件下500 rpm离心5 min，弃上清 |
| 悬浮细胞：将细胞悬液转移至冻存管， 在4 ℃条件下500 rpm离心5 min，弃上清 | |
| 用1 mL提前制备的预冷冻存液重悬贴壁/悬浮细胞沉淀，将冻存管置于程序降温盒中，梯度降温后放入- 80 ℃冰箱保存 | |
| 备注 | 配置冻存液（80 %完全培养基+10% FBS+10% DMSO）， 4 ℃保存 |
4. 样品包装与储存
| 样本包装与储存 |
| 请同时在管盖和管壁上标记样本信息 |
| 如使用1.5mL-2 mL离心管，请确保质量好（管壁越厚越好） |
| 为确保实验顺利进行， 每个细胞样本准备2份， 动物样本每份≥100mg ，单独分装于冻存管中，一份为实验样本， 一份为备份样本 |
| 如需混样，请混合好再寄送，避免混样过程中造成样本损失或降解 |
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
5. 样品运输
| 样本运输注意事项 |
| 装有样本的离心管管盖用封口膜封住，和样本信息单一起装入自封袋中，样本信息单电子版发送给销售，销售发送给运营部门和收样部门 |
| 往运输的泡沫箱中倒入一半体积干冰，放入装有样本和样本信息单的自封袋， 再倒入干冰将泡沫箱填满， 使样本位于干冰中间 |
| 为了大程度的保证样本的完整性，建议用4 cm厚度泡沫箱，冻存管运输， 15 kg颗粒状干冰运输 |
| 动物组织样本运输时建议用气泡膜用1.5 mL-2 mL离心管包起来，或者将用1.5 mL-2 mL离心管装入50 mL离心管中 |
| 植物样本可采取以下几种方式进行运输： 盆栽运输 ，低温运输，培养基运输， 以及其它可以保持样品新鲜的运输方式 |
对于新鲜的细胞样本，请在样本到达前至少提前2天和销售沟通，并安排好样本制备时间，保证样本在下午1点前送到 |
6. 声明
我司拒绝接收《人间传染的病原生物名录》 中危害程度为第一、第二类的高致病组
织、血液、细菌等样品，只接收提取得到的核酸样品。危害程度为第三、第四类的致病性或传染性的组织、血液、细菌等样品，必须事先联系销售、技术支持确认，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是研究蛋白质与DNA互作的新方法，相比于ChIP-Seq，该技术无需交联与超声打断操作，规避了抗原决定簇遮盖和样本损失问题，提高了信噪比，重复性好、实验周期短，自2019问世后便得到广泛应用。相比动物细胞，植物细胞要复杂一些，很多新技术遇到植物都要多一道门槛。CUT&Tag实验需要提前分离出高质量的细胞核，所以该技术在植物组织中的应用非常具有挑战性。
2021年4月，华中农业大学大学作物遗传改良国家重点实验室李兴旺课题组研究成果发表在Plant Biotechnology Journal上，研究首次报道了在植物中建立了单细胞核CUT&Tag (snCUT&Tag)方法[1]，可以高通量分析单个细胞核的组蛋白修饰特征。研究将开启植物单细胞表观基因组学研究的序幕。
在本研究中，作者进一步将nCUT&Tag技术与基于微流控的单细胞标记技术（10x Single Cell ATAC）相结合，首次建立了植物单细胞核CUT&Tag (snCUT&Tag)技术。该方法首先分离水稻细胞核，随后将细胞核与抗体孵育，使抗体结合到靶蛋白上；然后与protein G-Tn5融合蛋白孵育，通过protein G与抗体的结合，将转座酶Tn5带到靶蛋白附近；加入Mg离子后，可以激活Tn5的转座活性，在靶蛋白附近原位切割DNA并在切口末端加上接头序列；Tn5切割并带上标签的细胞核加载到微流控单细胞标记芯片上，即可以标记并区分每一个单细胞的DNA信息，通过测序即可以分析成千上万个单个细胞的组蛋白修饰信息。
[1] Ouyang W, Zhang X, Peng Y, et al. Rapid and Low-Input Profiling of Histone Marks in Plants Using Nucleus CUT&Tag. Front Plant Sci. 2021;12:634679. Published 2021 Apr 12. doi:10.3389/fpls.2021.634679
