ChIA-PET技术，全称为：Chromatin Interaction Analysis by Patred-End sequencing，由2009年新加坡基因组研究院的阮一骏教授研究组在《Nature》上首次发表，是一种鉴定目的蛋白介导的全基因组DNA调控元件远程相互作用的高效技术。该技术是染色质免疫沉淀技术(ChIP)和邻近连接(proximity ligation) 的组合，利用能识别目的蛋白的特异抗体，通过染色质免疫共沉淀技术，特异性地富集目的蛋白和DNA的复合体；然后对复合体中的DNA进行末端修饰和临近连接，将线性距离较远、但空间上临近的两个DNA片段连接在一起，进而捕获远程互作的DNA调控元件
ChIA-PET 技术的出现，对于识别具有单一功能性转录因子的结合位点是一个重要突破，相比较ChIP-Seq 技术，ChIA-PET 技术在确定结合位点的同时，能够确定结合位点间的相互作用。另外，ChIA-PET技术通过超声打断DNA-蛋白质复合体，有效减少因利用限制性内切酶引入的一系列相互作用的噪音。ChIA-PET技术为进一步研究基因组三维空间结构与功能提供了完整解决方案。
针对肿瘤基因组学中非编码区域风险变异的功能靶点识别难题，ChIA-PET技术展现了其独特的应用价值。在非小细胞肺癌的研究中，全基因组关联研究（GWAS）发现了多个与非编码区和基因间区显著相关的风险单核苷酸多态性（SNP），然而这些SNP调控的下游靶基因长期难以确定。研究人员应用RNA聚合酶II（RNAPII）介导的ChIA-PET技术，在肺癌细胞中绘制了高分辨率的长距离染色质相互作用图谱。核心发现表明，位于6号染色体基因间区的SNP rs34662244所在区域存在一个活跃的远程调控回路，该区域通过染色质环直接与ZSCAN16、ZSCAN16-AS1及ZNF165三个基因的启动子发生特异性互作。这一发现不仅成功将非编码风险位点与靶基因在三维空间上实现了精准关联，还揭示了肺癌易感性变异通过远程染色质环调控靶基因表达的分子机制，为后续的功能验证和肺癌风险评估提供了关键靶点信息。该案例充分展现了ChIA-PET技术在连接非编码风险变异的远程靶基因、解析疾病调控网络中的应用价值。
ChIA-PET样本送样指南
目录
1. 采集前注意事项
2. 送样要求
3. 样品送样指南
细胞
动物组织
植物组织
4. 样品包装与储存
5. 样品运输
6. 声明
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
1. 采集前注意事项
| 重复性 | 所有类型样本均需≥3个/组 |
| 无污染 | 放置样本的管子需无菌，并保证样本新鲜 |
| 为保证测序结果，请保证样本无其他微生物污染（如：支原体，噬菌体） | |
| 样本量 | 样本送量需达到本文档中规定的最低要求 |
2. 送样要求
| 项目类型 | 细胞样本 | 组织样本 | ||||||
| 细胞数量 | 细胞干体积（uL） | 动物组织（mg） | 植物组织（g） | |||||
| ChIA-PET | ≥108 | ≥ 400 | 心、脑、肾、肺 | 肝、脾、胃 | 皮肤、血管、软骨组织、骨等坚韧组织 | ≥4 | ||
| ≥2000 | ≥2000 | ≥4000 | ||||||
注：组织样本包含动植物组织样本。
3. 样品送样指南
| 细胞 | |
| 贴壁细胞 | 显微镜下观察细胞，确定生长状态良好，细胞聚合度在80%-90%为宜； |
| 直接吸弃旧培养基，用预冷的1×PBS清洗细胞，注意保持细胞贴壁，不要晃动细胞，重复洗一次； | |
加入少量1×PBS，用无菌细胞刮刀，将细胞刮下，4℃ 1500g离心5分钟，去掉PBS，将细胞收集到1.5-2mL细胞冻存管（或EP管）中， 估计细胞干体积的量，一般10µL细胞干体积对应于107个细胞，对应于1个90%细胞聚合度的10cm皿的细胞量 （该对应比例关系以HeLa细胞为例，不同细胞的大小不同，该对应比例会有出入，仅供参考）； | |
| 液氮速冻，干冰寄送。 | |
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
| 悬浮细胞 | 显微镜下观察细胞，确定生长状态良好，细胞聚合度在80%-90%为宜； |
收集细胞悬液到15mL或50mL离心管中，4℃ 1500g离心5分钟，去掉旧培养基，用预冷的1×PBS重悬并清洗细胞，上述离心去掉洗涤液，重复洗一次； | |
将细胞收集到1.5-2mL细胞冻存管（或EP管）中，估计细胞干体积的量，一般10µL细胞干体积对应于107个细胞， 对应于1个90%细胞聚合度的10cm皿的细胞量（该对应比例关系以HeLa细胞为例，不同细胞的大小不同，该对应比例会有出入，仅供参考）； | |
| 液氮速冻，干冰寄送。 |
注意事项
1） 细胞收集实验过程中使用的试剂和耗材必须是无酶无菌的，并尽可能在超净工作台上进行操作；
2） 如细胞与其它物种共培养，请您提前告知，并在送样清单中填写清楚，避免存在信息不畅导致执行问题；
3） 如您需要送备份样本，或同一个样本需要做2种及以上类型实验，请送样前分装好，并按照不同实验类型的取样方式和取样量取样，避免分装样本中可能造成的污染、核酸降解、样本误用等问题；
4） 细胞培养时易被支原体污染，样本核酸提取以及建库测序过程中难获悉是否污染，建议您送样前对细胞进行支原体检测，以确认无污染后再送样品；
5） 如果有条件，最好在收集样品时，完成交联操作，交联后再收集样品可以更好的保留细胞处理最原始状态时的核酸-蛋白相互作用；
甲醛、EGS双交联（ChIA-PET）：
1. 收集在推荐条件下培养至约80%聚合度的细胞，于室温（18-22°C）下200g离心5分钟。弃去培养基，用10 ml 1×PBS缓冲液洗涤细胞沉淀（约10^8个细胞）一次。再次于室温下200g离心5分钟，弃去PBS缓冲液。
2. 在通风橱中制备EGS固定液：将0.02 g EGS溶于200 µl DMSO（37°C加热5分钟溶解），随后与29.8 ml 1×PBS混合，得到终浓度1.5 mM的溶液。将EGS混合液置于37°C水浴中备用。
3. 将细胞沉淀重悬于30 ml新鲜配制的EGS固定液中，室温下旋转混合45分钟。
4. 向固定液中加入833 µl 37%（体积比）甲醛溶液，使其终浓度达1%（体积比），室温旋转混合20分钟。
5. 加入2.68 ml 2.5 M甘氨酸至终浓度0.2 M以终止交联反应，室温旋转混合5分钟。400g离心5分钟（室温），将上清弃置于专用废液容器。
6. 用20 ml预冷的1×PBS缓冲液洗涤细胞沉淀。4°C下400g离心5分钟，弃去PBS缓冲液。
7. 重复步骤6。
8. 液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送。
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
| 动物组织 | |
新鲜组织 ≥ 100 mg | 活体取样，剔除结缔组织以及其它非研究组织 |
| 用预冷的PBS漂洗（PBS需不含Mg2+和Ca2+，即DPBS），去除血液和杂质 | |
| 体积较大的组织需切割成绿豆大的小块 | |
| 将样本装入事先做好标记的组织保存液管中，立即放在冰上干冰寄送。 | |
注意事项
1） 严禁寄送活体动物；
2） 建议优先采集新鲜组织样品送样，尽量避免送保存过久的组织样本和反复冻融的组织样本；
3） 如需要截取样本部分区域进行提取，请您送样前截取好，避免因取样部位不符合您的要求影响实验结果；
4） 使用液氮速冻取样，请在组织离体10min内完成所有取样操作，以防止取样时间过长导致组织样本中蛋白降解；
5） 样品采集时每管样本量需要充足够一次提取的量，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解；由于核酸易降解，难以保证提取质量，建议客户送样前对样品进行备份，以备不时之需；
6） 如您需要送备份样本，或同一个样本需要做2种及以上类型实验，请送样前分装好，并按照不同实验类型的取样方式和取样量取样，避免分装样本中可能造成的污染、RNA降解、样本误用和不足等问题；
7） 组织样品大小在满足提取总量所需基本要求外，尽量使样品易于取出，具体体现为锡纸折叠整齐有条理，不要团成团；自封袋分类合理有效，不要多余分装；冻存管中样品不易塞满，如果为多次提取提供样品，建议分装；
8） 为避免运输途中出现异常情况，建议采用带有螺口的冻存管送样，管壁上标明样品名称；一般不建议EP管送样，不得已用EP管时，EP管口需用封口膜封严，避免运输过程中损坏，导致样品受损；
9） 新鲜组织收集后，一定要进行液氮速冻，液氮冻存速度很快，可以更好的保留细胞处理的最原始状态。
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
| 植物组织 | |
| 新鲜组织 | 植物接受新鲜样本，待测样本用dd H2O洗去组织表面泥土等杂质，吸干水分 |
| 将植物组织样本用剪刀分割成1-2cm或50-100mg的小块，根据组织块大小，置于2mL、15mL或50mL 离心管中； | |
| 液氮速冻后，-80℃保存； | |
注意事项
1） 建议优先采集新鲜组织样品送样，尽量避免送保存过久的组织样本和反复冻融的组织样本；
2） 如需要截取样本部分区域进行提取，请您送样前截取好，避免因取样部位不符合您的要求影响实验结果；
3） 使用液氮速冻取样，请在组织离体3-5min内完成所有取样操作，以防止取样时间过长导致组织样本中RNA降解；
4） 样品采集时每管样本量需要充足够一次提取的量，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解；
5） 如您需要送备份样本，或同一个样本需要做2种及以上类型实验，请送样前分装好，并按照不同实验类型的取样方式和取样量取样，避免分装样本中可能造成的污染、蛋白降解、样本误用和不足等问题；
6） 组织样品大小在满足提取总量所需基本要求外，尽量使样品易于取出，不要把锡纸团成团；自封袋分类合理有效，不要多余分装；冻存管中样品不易塞满，如果为多次提取提供样品，建议分装；
7） 为避免运输途中出现异常情况，建议采用带有螺口的冻存管送样，管壁上标明样品名称；一般不建议EP管送样，不得已使用EP管时，EP管口需用封口膜封严，避免运输过程中损坏，导致样品受损；
8） 新鲜组织收集后，一定要进行液氮速冻，液氮冻存速度很快，可以更好的保留细胞处理的最原始状态，避免其他冻存方式时间较长，可能会导致细胞内部核酸和蛋白互作关系失去最原始的状态。
9） 如果有条件，最好在收集样品时，完成交联操作，交联后再收集样品可以更好的保留最原始状态时的核酸-蛋白相互作用；
甲醛、EGS双交联（ChIA-PET）：
① 幼苗剪碎于144ml 1×PBS + 4ml 37%甲醛，抽真空25min。
② 加13.2 ml 2.5M 甘氨酸（2.82g 甘氨酸 + 15ml 双蒸水），抽真空5min，终止反应。
③ 用双蒸水洗三次。
④ 加1.5mM EGS（0.06g EGS + 600μL DMSO，溶解后加入37℃的89.4ml 1×PBS）
⑤ 抽真空45min。
⑥ 双蒸水洗3～4次。
⑦ 吸水纸吸干，保存于-80℃。
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
4. 样品包装与储存
| 样本包装与储存 |
| 请同时在管盖和管壁上标记样本信息 |
| 如使用1.5mL-2 mL离心管，请确保质量好（管壁越厚越好） |
为确保实验顺利进行，每个细胞样本准备2份，动物样本每份≥100 mg，单独分装于冻存管中，一份为实验样本，一份为备份样本 |
| 如需混样，请混合好再寄送，避免混样过程中造成样本损失或降解 |
5. 样品运输
| 样本运输注意事项 |
装有样本的离心管管盖用封口膜封住，和样本信息单一起装入自封袋中，样本信息单电子版发送给销售，销售发送给运营部门和收样部门 |
往运输的泡沫箱中倒入一半体积干冰，放入装有样本和样本信息单的自封袋，再倒入干冰将泡沫箱填满，使样本位于干冰中间 |
为了大程度的保证样本的完整性，建议用4 cm厚度泡沫箱，冻存管运输，15 kg颗粒状干冰运输 |
动物组织样本运输时建议用气泡膜用1.5 mL-2 mL离心管包起来，或者将用1.5 mL-2 mL离心管装入50 mL离心管中 |
对于新鲜的细胞样本，请在样本到达前至少提前2天和销售沟通，并安排好样本制备时间，保证样本在下午1点前送到 |
6. 声明
我司拒绝接收《人间传染的病原生物名录》中危害程度为第一、第二类的高致病组 织、血液、细菌等样品，只接收提取得到的核酸样品。危害程度为第三、第四类的致病性或传染性的组织、血液、细菌等样品，必须事先联系销售、技术支持确认，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
Note: Refuse to accept highly pathogenic and infectious samples！
注意:拒绝接收高致病性和传染性样品！
针对肿瘤基因组学中非编码区域风险变异的功能靶点识别难题，ChIA-PET技术展现了其独特的应用价值。在非小细胞肺癌的研究中，全基因组关联研究（GWAS）发现了多个与非编码区和基因间区显著相关的风险单核苷酸多态性（SNP），然而这些SNP调控的下游靶基因长期难以确定。研究人员应用RNA聚合酶II（RNAPII）介导的ChIA-PET技术，在肺癌细胞中绘制了高分辨率的长距离染色质相互作用图谱[1]。核心发现表明，位于6号染色体基因间区的SNP rs34662244所在区域存在一个活跃的远程调控回路，该区域通过染色质环直接与ZSCAN16、ZSCAN16-AS1及ZNF165三个基因的启动子发生特异性互作。这一发现不仅成功将非编码风险位点与靶基因在三维空间上实现了精准关联，还揭示了肺癌易感性变异通过远程染色质环调控靶基因表达的分子机制，为后续的功能验证和肺癌风险评估提供了关键靶点信息。该案例充分展现了ChIA-PET技术在连接非编码风险变异的远程靶基因、解析疾病调控网络中的应用价值。
[1] Zhang Y, Zhang J, Zhang W, et al. Mapping Multi-factor-mediated Chromatin Interactions to Assess Dysregulation of Lung Cancer-related Genes. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2023;21(3):573-588. doi:10.1016/j.gpb.2023.01.004
